Определение пола осетров инвазивным методом

Инвазивный метод определения пола осетровых рыб

 Осетровые выращиваются, главным образом, для получения икры и высококачественного мяса.

Мясо самцов и самок твердое и белое, а икра получается только от зрелых самок. Типичный производственный протокол, в зависимости от вида осетра, включает сбор самцов на мясо (на 2-4 году жизни) и сбор самок на икру (на 5-9 году жизни). Так как стратегия по отношению к мужским и женским особям отличается, необходимо точно определять пол рыб. Этого очень сложно добиться, потому что осетровые не имеют внешних половых отличий, особенно в молодом возрасте (3 года от вылупления). С другой стороны, манипуляции с хромосомами, которые успешно применяются в отношении лососевых, не эффективны для осетровых.

На сегодня существуют немногочисленные процедуры определения пола рыб. Можно измерять концентрацию половых гормонов (естрогена, прогестерона, тестостерона) или других метаболических индикаторов, например, предшественника формирования желточного мешка – вителлогенина в крови или слизи. Однако данный метод требует день работы в лаборатории и непригоден для полевых исследований.

Немедленно определить пол осетра можно лишь двумя способами:

непосредственное наблюдение гонад (1) с использованием хирургических процедур, либо (2) с использованием ультразвуковой диагностики. Наибольшее распространение получил метод ультразвуковой диагностики брюшной полости с подходящим датчиком, который позволяет различить яичники или семенники. Данный способ надежен, когда гонады хорошо развиты, главным образом, у зрелых особей (36 месяцев). Процедура оказывается не точной при идентификации пола молодых особей (12-24 месяца).

В данной статье описывается стандартная методика и инструменты для определения пола осетровых рыб с помощью хирургического вмешательства. Она включает выполнение небольшого надреза для доступа к брюшной полости и непосредственное наблюдение гонад, введение инструмента (эндоскопа, лапароскопа, бороскопа и других), либо взятие биоптата. Гонады или образцы биоптата могут рассматриваться невооруженным глазом (макрокопически), с использованием увеличительных линз. Гистологический анализ биоптата проводится под микроскопом. Хирургическая биопсия является самым надежным способом определения пола молодых особей (16-36 месяцев) и степени зрелости гонад. Хирургическая процедура, предусматривающая анализ биоптата гонад, является «золотым стандартом» или эталоном проверки точности альтернативных методов определения пола. Она может производиться в полевых условиях и при определенной сноровке смертность будет минимальной. Как правило, гибель после проведения операции происходит, вследствие инфекции при выдерживании осетра в воде с высокой температурой или плохого качества. Хирургическое вмешательство занимает не более 2 минут на особь и не требует дорогих хирургических инструментов. Процедура имеет недостатки, связанные с её травматичностью, хотя и минимальной. К их числу относятся возможность занесения инфекции, относительно высокая длительность анализа (несколько минут). Кроме того, используются хирургические нити, стоимость которых на каждую особь достигает 1 $. Наконец, не смотря на относительную простоту операции, необходимо развитие умений и навыков её проведения.

Манипуляции с рыбой и обучение неквалифицированного персонала должны проводиться под присмотром опытного ихтиолога или ветеринара.

Материалы

1. Источник чистой, насыщенной кислородом (аэрируемой) воды;

2. Анестетик;

3. Емкость для содержания рыб;

4. Инвентарь для проведения манипуляций с рыбой: носилки, козелки, сети с подъемником;

5. Хирургический инструментарий: хирургические перчатки, скальпель (№3), лезвия (номера 10, 11, 15).

Пинцет для забора ткани Браун-Адсона (с 7х7 зубцами) и тканевой пинцет Эллиса (4х5 зубцов).

Тяжелые иглодержатели или ножницы (Олсен-Хигера) для удерживания иглы во время сшивания шва.

Рассасывающийся шовный материал:

Викрил (полиглактин 910) размером 0 или 1 с шестью или четырьмя обратнорежущими хирургическими иглами;

PDS II (полидиоксанон) с 1 CP-1 режущей иглой.

6. Другой инвентарь: листы или блокнот (предпочтительно водостойкий);

ручка/карандаш; ящик для инструментов;

небольшой контейнер для хранения инструментов в стерильных условиях;

полотенце для рук;

столик для инструментов;

стерильные салфетки, спирт, йод для дезинфекции инструментов;

контейнер для мусора и израсходованных материалов; яркий источник света.

Протокол

Хирургическая процедура малотравматична и надежна в определении пола осетра. Опытный сотрудник способен выполнить около 300-500 операций в день. Успех некоторых элементов процедуры (тип анестезии и принятие решения о наложении шва) определяется правовым полем государства, уровнем комфорта сотрудника и возможностью занесения инфекции. Целью её проведения является отделение самцов и отбор самок с четкими различимыми яичниками. Когда пол рыб трудно определить, они часто получают статус «неизвестные» и могут пойти на мясо.

Отлов и анестезия

Изначально, осетр аккуратно, без стрессирования рыбы, вылавливается сетями или сачком. Затем вводится анестезия до момента, когда особь переворачивается вверх брюшком и замедляет движения жаберными крышками. В качестве анестетика используется MS-222 (Трикаина метансульфонат). Наркотизированная таким образом рыба перед использованием её в пищу должна пройти 21 день очищения. MS-222 закисляет среду, благодаря образованию метансульфокислоты, особенно, в мягкой воде с низкой щелочностью. pH воды необходимо проверять, и, если показатель окажется слишком низким (<6.5), в ванну с наркотизации следует добавить буфер бикарбонат натрия. Среди других наркотизирующих средств можно отметить 2-феноксиэтанол ( 300 мг/л) и бензокаин (BZ-20 100-150 мг/л).

Альтернативой озвученным выше анестетикам является производные гвоздичного масла, Aqui-STM (75-150 мг/л) и Aqui-S20E (476-537 мг/л).

Осетровые успешно наркотизируются погружением в холодную воду (10–12°C) с введением CO2 и чистого кислорода. После наркотизации рыба помещается брюшком вверх. Опытные сотрудники обычно держат рыбу вне воды не более 2-3 минут, но при более длительном пребывании на воздухе жабры следует ополаскивать чистой, нехлорированной водой. При соответствующей форме сачка или козел голова осетра может находиться в воде, а брюшная область на воздухе.

Дезинфекция

Хирургическая операция должна выполняться в стерильных, асептических условиях, насколько это возможно. Следует одевать хирургические перчатки и дезинфицировать инструмент. Элементарная дезинфекция включает ополаскивание инвентаря детергентом и окунанием в раствор 70% этанола, 65-90% изопропилового спирта, 1-3,5% раствор йода (внимание: концентрация йода более 3,5% токсична для тканей и не обеспечивает дополнительной дезинфекции). Осетровые выделяют много слизи, обладающей антибактериальной активностью, поэтому их тело не требует дополнительной обработки. Не рекомендуется обрабатывать, очищать, осушать раневую поверхность, потому что это повреждает ткани рыб. Если выделяется слишком много слизи, следует аккуратно промокнуть раневую поверхность стерильной марлей с 1% раствором йода.

Надрез

Наилучшее место для надреза располагается под печенью на правой стороне рыбы, где относительно легко выделяется правая гонада. Доступ к левой гонаде затруднен, потому что на неё налегает селезенка. Надрез производится 1-5 см от вентральной срединной линии, напротив 3-5 вентральной жучки спереди от брюшного плавника. Это место откроет доступ непосредственно или чуть выше гонады. Точное расположение надреза зависит от вида и специфических особенностей каждой особи. Осетровые демонстрируют удивительное разнообразие телесной конституции и модели жучек. В большинстве случае, гонада хорошо видна через надрез.

Рисунок 1.

Расположение надреза брюшной полости у белого осетра, используемый для визуальной идентификации пола. Кончик лезвия находится в месте предполагаемого надреза, примерно 3-4 вентральных жучки спереди от брюшного плавника и по середине между срединой линии и жучками

Надрез выполняется скальпелем или ножницами. Он имеет длину 1-3 см; длина зависит от используемого метода. Она самая маленькая при эндоскопическом исследовании и самая большая при заборе биоптата. Единичный сквозной надрез без подъема скальпеля предпочтителен. Он минимизирует кровотечение и повреждение тканей. Брюшная сторона тела вдоль срединной линии осетровых плохо кровоснабжается. Таким образом, лучше делать надрез слегка отойдя от центра, минуя хорошо васкуляризированные мышцы. Рассечение тканей и осмотр гонад проводится, как можно быстрее, желательно до момента обильного кровотечения. Исследование В некоторых случаях гонады очень мелкие и покрыты жиром. Подспорьем при проведении манипуляций будут тканевые пинцеты Эллиса (4х5 зубцов), которые используются для смещения гонад. Кроме того они применяются для забора биоптата.

Во время проведения операции нужно иметь при себе источник освещения в направлении раны (фонарь на голове). Некоторые рыбоводы не видят гонады при дневном свете, но замечают их при правильном расположении тела рыбы по отношению к свету. Гонады осетровых парные, состоят из жировой (адипозной ткани) и «герминальной ткани», где развиваются сперматозоиды и икринки. Окраска гонад варьирует (белая, желтая, оранжевая) в зависимости от условий выращивания, рациона питания. Основной проблемой является различение ткани яичников от адипозной ткани. Яичники самок обычно темнее, чем семенники, которые, в свою очередь, беловатые или желтоватые. Однако «определяющим признаком» являются «яйцепроизводящие петли» — участки, в которых развиваются икринки. По форме петли напоминают собранную в складки занавеску. При рассмотрении сверху они напоминают клавиши от пианино. Овариальная ткань также имеет зернистую текстуру, образованную икринками в петлях. В мужских гонадах присутствует жировая ткань, однако тестикулярная ткань гладкая, беловатая, напухшая; зрелые семенники выглядят как белые распухшие доли. Изредка рыбовод будет находить половозрелых самцов. В данном случае, если ткань семенников повреждена, можно видеть белую и кремово-вязкую тестикулярую жидкость.

Рисунок 2.

a. Внешний вид семенников самца осетра, и

b. Яичник самки.

У обоих гонад состоят из адипозной ткани и герминальной ткани, где развиваются сперматозоиды и икринки Так как гонады осетровых рыб видны в брюшной полости, их можно дифференцировать путем пальпации. У самок чувствуются гранулы икринок и яйцепроизводящие петли. Семенники, напротив, гладкие на ощупь.

Рисунок 3.

a. Гонада самки с ооцитами в изгибах яичника и прилегающая жировая (адипозная) ткань; поверхность на ощупь бугристая;

b. Семенники самца без жировой ткани; отмечаются отдельные белые доли;

поверхность гладкая на ощупь

Если после рассмотрения и ощупывания нельзя определить пол рыбы, необходимо удалить небольшой участок ткани пинцетом Эллиса или другим инструментом. Биоптат берется из герминальной ткани гонад и помещается в консервант (10% нейтральный буферизированный формалин или 70% раствор этанола) для дальнейшего гистологического исследования.

Отмечено, что в консерванте оседает ткань, взятая у самцов. Ткань семенников более плотная, чем ткань яичников, потому что она содержит цисты, наполненные развивающимися сперматозоидами.

Наложение шва

После определения пола может потребоваться наложение шва. В некоторых случаях, когда количество особей насчитывает тысячи, наложение шва не производится. При длине раны менее 2 см процесс заживления проходит очень быстро и травма не опасна. С другой стороны, при интенсивном разведении в УЗВ или прудовом выращивании рекомендуется наложение шва, который препятствует заражению рыб.

Рисунок 4.

Хирургический инструмент: пинцет для забора ткани Браун-Адсона (с 7х7 зубцами), скальпель (№3) с лезвиями (номера 10, 15), тканевой пинцет Эллиса (4х5 зубцов), иглодержатели или ножницы

Эта процедура требует опыта и инструментов (скальпель с лезвиями, тканевой пинцет Браун-Адсона и тяжелый иглодержатель с зубчатыми губами). Пинцет Браун-Адсона идеальный вариант, потому что он имеет зубцы, цепляющие, но не травмирующие скользкую кожу осетра. Хирургические иглодержатели с парой зазубренных губ существенно упрощают удерживание иглы, которая должна иметь большой калибр для проникновения в кожу. Набор иглодержатель, ножницы облегчают процесс наложения шва. Рассасывающиеся шовный материал прочный, пластичный и прикрепленный к обратнорежущей игле, наилучший для осетровых (PDS II и Викрил размером 0 или 1, прикрепленные к иглам CP-1 и OS-4/6, соответственно).

Хирургическая игла с ниткой для непрерывного шва на конце имеет диаметр, эквивалентный диаметру нити. Этот тип нити менее травматичен для кожи рыбы, которая жесткая, недостаточно эластичная, часто совмещена с дермальными мелкими жучками.

Рассасывающийся шовный материал из тонкой кишки работает хорошо только при содержании рыб в холодной воде (ниже 15 °C) до полного заживления. В более теплой воде они рассасываются до полного заживления раны (полное заживление составляет 20-30 дней), и ткань воспаляется. Эффективность других материалов для сшивания (тканевой клей, скобы) только испытываются на осетрах.

Рисунок 5.

Хирургические узлы. Рекомендуются единичные или прерываемые X-образные рисунки для обвязки и закрепления шва

Для наложения швов и связывания узлов, использовать основные хирургические методы наложения швов. Небольшие раны (1-3 см) могут сшиваться с прерываниями. Для длинных ран (3-5 см) рекомендуется горизонтальный шов, потому что он прочный и стремится вывернуть внутренние края раны наружу, что ускоряет заживление.